La Sala Zuccari è l'unico ambiente rimasto inalterato durante le numerose ristrutturazioni di Palazzo Giustiniani. La galleria, ubicata al primo piano, è interamente decorata ad affresco. I problemi di attribuzione delle opere restano parzialmente aperti. Il nome della Sala si deve all'artista Federico Zuccari (1539-1609), cui era stata originariamente attribuita la paternità degli affreschi della volta. Più recenti studi, invece, indicano in Antonio Tempesta (1555-1630) e Pietro Paolo Bonzi (1576-1636) i più probabili realizzatori dei dipinti, che vennero eseguiti tra il 1586 e il 1587, quando il Palazzo non apparteneva ancora ai Giustiniani.
Sala Zuccari è un ambiente di circa 18 metri per 7, che originariamente ospitava un'importante collezione di antichità, stimabile in circa duecentocinquanta pezzi, tra statue e busti, disposti su più livelli. I quadri stabilmente esposti erano di numero inferiore, anche in relazione al fatto che la Sala, già affrescata sulle pareti, mal si prestava ad accogliere dipinti. Quindici delle opere dei grandi maestri del Cinquecento e del Seicento (Veronese, Dosso Dossi, Palma il Vecchio, Baldassarre Peruzzi, Domenichino, Tiziano, Caravaggio) furono riportate nel ricco inventario della collezione Giustiniani del 1638.
Le alterne vicende dinastiche ed economiche della famiglia Giustiniani portarono, nel corso del tempo, ad un progressivo depauperamento della collezione, fino alla sua totale dispersione. Le opere furono acquistate dai Torlonia e dal re di Prussia, Federico Guglielmo III.
Attualmente la Sala è sede di convegni e mostre ospitati dal Senato della Repubblica.
Nella volta sono raffigurati cinque episodi delle storie della vita di Salomone ("Salomone unto re", "La costruzione del Tempio", "Il giudizio di Salomone", "I figli costretti a trafiggere il cadavere del padre" e, al centro, "L'incontro di Salomone con la regina di Saba") e le quattro virtù a lui attribuite (Religione, Industria, Vigilanza, Eloquenza). Le colonne tortili in bronzo, che si articolano sulle pareti su cui sono affrescate, alludono al Tempio di Salomone ed evocano, allo stesso tempo, l'atmosfera di un portico antico.
Vicino agli angoli della volta sono raffigurati piccoli paesaggi, in cornici circolari. Sulle pareti erano raffigurate immagini femminili di virtù, ma attualmente ne rimane solamente una, a figura intera, "La Temperanza", mentre delle altre restano solo alcuni frammenti. Tutte le decorazioni sono ordinate entro una superficie decorata a grottesche e l'insieme ha un aspetto sontuoso, arricchito anche dagli arazzi seicenteschi. I cinque arazzi presenti sulle pareti ("Il battesimo di Gesù", "L'apparizione di Cristo alla Maddalena", "La visitazione", "La prudenza", "L'abbondanza") sono stati realizzati nelle arazzerie medicee e sono di proprietà delle Gallerie di Firenze (attuale Polo Museale Fiorentino). Recentemente restaurati in collaborazione con il Laboratorio Arazzi dell'Opificio delle Pietre Dure di Firenze, hanno riacquistato tutto il loro splendore originario, dovuto anche all'utilizzo, tra i materiali tessili, di fili di rame ed argento. Di questi, i primi tre sono attribuiti ad Alessandro Allori e gli ultimi due a Pietro Fevere e Michelangelo Cinganelli.