Il nucleo originale di Palazzo Giustiniani fu realizzato alla fine del Cinquecento da monsignor Francesco Vento. L'immobile fu ceduto il 4 luglio 1590 a Giuseppe Giustiniani, esponente di una delle più ricche e potenti famiglie genovesi. Originari dell'isola di Chio, sulla quale governavano per conto della Repubblica di Genova, i Giustiniani nel 1566 furono costretti ad abbandonare l'isola a causa delle vessazioni turche e si trasferirono a Roma, in via della Dogana, centro finanziario e burocratico della Roma papale. Nel 1590, dunque, i Giustiniani entrarono in possesso del Palazzo, che prese poi il loro nome, e negli anni seguenti acquistarono altri edifici ad esso contigui; più che della costruzione di un palazzo vero e proprio, infatti, si deve parlare di un accorpamento di edifici, il quale con il trascorrere degli anni determinò la costituzione di un'insula giustinianea fra le strade a ridosso del Pantheon.

La famiglia ospitò nel Palazzo la propria collezione di opere d'arte, affittandolo anche, in tutto o in parte, a prelati e personaggi importanti in cerca di una sistemazione di prestigio. Successivamente alcuni lavori di ampliamento videro, oltre a modifiche all'interno dell'edificio, anche il completamento della facciata principale su via della Dogana. La famiglia Giustiniani si estinse alla fine dell'800 e tale evento portò alla dispersione della grande collezione di opere d'arte. Intorno ai primi anni del '900 il Ministero della Pubblica Istruzione prese provvedimenti per arginare tale dispersione e cedere allo Stato i pezzi più preziosi. In quegli anni, una parte della proprietà passò alla Cassa di Risparmio di Roma ed un parte venne affittata al Grande Oriente d'Italia. All'inizio del 1926, Mussolini aderì alla richiesta dell'allora Presidente del Senato del Regno, Tommaso Tittoni e concesse l'utilizzo di Palazzo Giustiniani al Senato, ma soltanto nel 1988 il Senato acquisì la quasi totale disponibilità dell'immobile. Proprio in questo palazzo, e precisamente nella biblioteca, venne firmata da Enrico De Nicola la Costituzione repubblicana. Nel Palazzo hanno sede, oltre all'appartamento di rappresentanza del Presidente del Senato, la Sala Zuccari, gli uffici dei senatori di diritto e a vita, degli ex Presidenti del Senato, nonché alcuni servizi ed uffici dell'Amministrazione.